化學發(fā)光試劑的制備常規(guī)

發(fā)布日期：2016-08-04 作者：點擊：

化學發(fā)光試劑印跡膜制備,按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作,適當的封閉非常重要.可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交聯物.仔細地淋洗對于降低背景非常重要,在與HRP交聯物溫育后,膜片更需仔細洗滌,所有步驟均在室溫下完成.化學發(fā)光試劑的配置,在使用前等量混合A液和B液,混合后盡快使用.將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片.蛋白信號顯現.

用平頭鑷鉗住膜片,垂直置于吸水紙以吸去過量試劑.置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡.將膜片吸附蛋白面朝上,置于X光片盒中.于暗室中壓上X光片.根據信號的強弱適當調整曝光時間,一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達zui佳效果。顯影沖洗.調節(jié)曝光時間,再次曝光顯影.

化學發(fā)光試劑操作注意,本試劑每個批號均獨立優(yōu)化,請不要混用或稀釋本試劑以免降低敏感性.加入一抗后膜不能再干燥.適當地封閉和洗滌膜片至關重要.使用前配置化學發(fā)光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可,棄去使用過的混合試劑.使用干凈取樣頭取用每種試劑.*張片子建議曝光1分鐘，觀察結果后判斷zui佳曝光時間可從30秒至2小時不等.除了放射自顯影片曝光和洗片處理外,所有步驟均不必在暗室中操作,膜片可經適當方法洗脫原有抗體,再次印跡使用,在此情況下,此試劑更為理想.因為它不象生色物質需要從膜片上清除底物.NaN3能抑制HRP活性,應避免使用NaN3.

化學發(fā)光試劑用途,本試劑是非放射性發(fā)光系統(tǒng),用于檢測固定在膜上的蛋白,其敏感性達1-5pg.用X光片可快速地獲得*的硬拷貝結果.所含獨特的底物足以維持12小時以上的發(fā)光,便于反復曝光操作,免疫印跡膜經抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。特別節(jié)省抗體(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。原理,辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強劑這使得發(fā)光增強了1000倍。在免疫印跡中，將復雜的蛋白混合物經SDS-PAGE分離，并轉移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。當加入免疫印跡化學發(fā)光試劑后，Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經X光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。